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【摘要】目的 建立一种基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR/Cas13a）的乙型肝炎病毒（HBV）共价闭合环状DNA（HBV cccDNA）检测方法。方法 提取2017年6月至2020年10月于首都医科大学附属北京佑安医院就诊的4例乙型肝炎患者肝脏总DNA后，使用Hind Ⅲ内切酶和质粒安全性ATP依赖DNA酶（PSAD）分别进行酶切；根据松弛环状DNA（rcDNA）和cccDNA的结构差异，设计特异性扩增HBV cccDNA的引物，对酶切后的产物进行滚环扩增（RCA）和PCR扩增；并筛选crRNA，建立基于CRISPR/Cas13a技术的HBV cccDNA检测新方法。结果 利用α-1-抗胰蛋白酶（A1AT）和HBV表面抗原（HBsAg）引物对双重酶切后的产物进行扩增，验证产物中HBV基因组的存在；利用HBV cccDNA和HBV rcDNA引物对PSDA酶切后的产物扩增，验证了产物中只存在HBV cccDNA；利用RCA后的阳性样本作为模
板梯度稀释，然后进行PCR扩增转录后使用CRISPR/Cas13a检测，计算出检测下限为10拷贝/μl。结论 本研究建立了RCA-PCR-CRISPR-Cas13a的新型检测方法，可对HBV cccDNA进行高灵敏度和高特异性检测，为乙型肝炎患者抗病毒治疗评估、治疗终点的确定以及调整治疗方案提供了有效的监测手段。
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